Volkhp.ru

Аграрный журнал
3 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Температура культивирования

Оптимальная температура роста патогенных для человека микроорганизмов совпадает в основном с температурой тела человека. В отдельных случаях температурный параметр может быть использован как простой способ селекции, например, виды Campylobacterлучше растут при температуре 42ºС, слишком высокой для роста большинства других патогенов. В зависимости от требований к температурному режиму бактерии классифицируются на психрофилы, термофилы и мезофилы.

Мезофильные бактерии лучше всего растут в пределах 20-40ºС, к ним относится большинство патогенных для человека микроорганизмов.

Термофильные бактерии лучше растут при 50-60ºС.

Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10 ºС.

Состав газовой среды

Бактерии четко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культивирования.

Аэробы.Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факультативно-анаэробные виды можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практике их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после ее выгорания в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание углекислого газа.

Анаэробы.Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах – анаэростатах или микроанаэростатах, где создается бескислородная атмосфера физическими или химическими способами.

Культуральные свойства

После культивирования осуществляют культуральные свойства бактерий. Культуральными свойствами микроорганизмов называется характер их роста на плотных и жидких питательных средах. Изучение культуральных свойств проводят макроскопически в проходящем и отраженном свете и микроскопически, учитывая следующие характеристики: размер, форма, характер края, характер поверхности, консистенция, внутренняя структура и дается заключение о генетической форме колонии – S-форма (округлая, гладкая, влажная, с ровными краями, однородной внутренней структуры) иR-форма (шероховатая, с неровными краями, сухая, неоднородной внутренней структурой).

Из части колонии готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий остаток колонии пересевают на скошенный агар, для накопления чистой культуры в достаточном для последующей идентификации количестве.

Идентификация

Идентификация – определение (установление) видовой принадлежности микроорганизма. В настоящее время общепринятый метод идентификации основан на изучении определенного набора наиболее важных фенотипических признаков исследуемой бактерии. Критерием для идентификации является наличие у микроорганизма совокупности основных признаков, характерных для данного вида (таксономических признаков). Установление вида производится согласно международной таксономической классификации Берги (Bergey’sManualofSystematicBacteriology).

Основными видами идентификации являются:

Изучение морфологических свойств (форма, расположение), тинкториальных (особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски), культуральных (особенности роста на питательных средах).

Биохимическая идентификация – изучение способности микроорганизмов ферментировать различные химические соединения.

Для изучения биохимической активности бактерий используют следующие реакции: ферментацию, окисление, ассимиляцию (утилизацию), диссимиляцию (деградацию) и гидролиз субстрата. Классический (традиционный) метод идентификации микроорганизмов по биохимическим свойствам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроба ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением гликолитических (сахаролитических) и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их идентификации. При необходимости изучают другие свойства: способность к восстановлению нитратов, карбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и др.

Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на применении концентрированных субстратов и более чувствительных методов обнаружения конечных продуктов реакции, позволяют выявлять ферменты уже существующие в микробной клетке, и таким образом, не требуют дополнительного выращивания бактерий. Это позволяет существенно сократить сроки исследования (до 4 часов).

Биохимические тесты 3-го поколения основаны на применении субстратов, меченных хромогеном или флюорохромом. Такой комплекс не окрашен или не флюоресцирует. При разрушении меченного субстрата ферментом микроорганизма освобождается метка, что проявляется окрашиванием или флюоресценцией. Такие тесты позволяют использовать единичную бактериальную колонию, полученную при первичном посеве исследуемого материала на плотную питательную среду.

В лабораторной практике применяются готовые микротест-системы (МТС) для идентификации микроорганизмов. В современных МТС учет результатов и их интерпретация осуществляются автоматически с помощью компьютерных систем анализа.

Наряду с основными методами идентификации могут быть использованы:

Сероидентификация (изучение антигенного строения путем постановки различных серологических реакций).

Хемоидентификация (идентификация по химическому составу микробной клетки).

Хемоидентификация основана в первую очередь на анализе состава микробных липидов, осуществляемого с помощью метода хроматографии (метод газожидкостной хроматографии).

Фагоидентификация (чувствительность к видоспецифическим бактериофагам).

Способность к продукции определенных факторов вирулентности.

Видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам.

Молекулярно-генетические методы идентификации, основанные на анализе бактериальных ДНК (рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, полимеразная цепная реакция).

Питательные среды

1. Малая медицинская энциклопедия. — М.: Медицинская энциклопедия. 1991—96 гг. 2. Первая медицинская помощь. — М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. — М.: Советская энциклопедия. — 1982—1984 гг .

  • Пита́тельное отве́рстие
  • Пита́тельный кана́л

Смотреть что такое «Питательные среды» в других словарях:

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, искусственные среды того или иного состава, предназначенные для культивирования микробов и простейших в лабораторных условиях. Впервые были введены для изолирования отдельных видов бактерий Р. Кохом в 1881 году, что создало… … Большая медицинская энциклопедия

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — жидкие или твердые смеси веществ, на которых выращивают микроорганизмы в лабораторных или промышленных условиях. Содержат соединения, служащие источниками углерода, азота, фосфора, витаминов и других компонентов, необходимых для жизнедеятельности … Большой Энциклопедический словарь

питательные среды — жидкие или твёрдые смеси веществ, на которых выращивают микроорганизмы в лабораторных или промышленных условиях. Содержат соединения, служащие источниками углерода, азота, фосфора, витаминов и других компонентов, необходимых для жизнедеятельности … Энциклопедический словарь

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — среды, на которых выращивают живые организмы (напр., для водных культур высших растений). П. с. бывают: естественные, для бактерий и грибов (картофель, молоко и др.); искусственные для культур бактерий и грибов (мясопептонный бульон, желатин и др … Словарь ботанических терминов

Питательные среды — жидкие или плотные среды, применяемые для выращивания в лабораторных или промышленных условиях бактерий, дрожжей, микроскопических грибов, водорослей, простейших, вирусов и культур растительных или животных клеток. Синтетические П. с.… … Большая советская энциклопедия

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ — жидкие или твёрдые смеси в в, на к рых выращивают микроорганизмы в лаб. или пром. условиях. Содержат соед., служащие источниками углерода, азота, фосфора, витаминов и др. компонентов, необходимых для жизнедеятельности микробов … Естествознание. Энциклопедический словарь

Питательные среды бактериологические — жидкие, полужидкие или плотные субстраты, используемые для выращивания микроорганизмов в лабораторных или производственных условиях. Используют для выделения чистых к р бактерий, грибов и простейших из биогенных или абиогенных объектов, для… … Словарь микробиологии

Питательные среды для бактерий — Под этим именем подразумевают различного рода субстраты, приготовляемые для изучения жизнедеятельности микроорганизмов при определенных условиях, изменяемых по воле экспериментатора. Микрохимические анализы и опыты искусственной культуры выяснили … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона

питательные среды Гисса — см. Гисса среды … Большой медицинский словарь

питательные среды Дифко — см. Среды Дифко … Большой медицинский словарь

питательные среды Лифсона — см. Лифсона среды … Большой медицинский словарь

Микрочип против инфекций: разработанный учеными ЛЭТИ метод экспресс-диагностики микроорганизмов повысит эффективность использования антибиотиков

Ученые Санкт-Петербургского государственного электротехнического университета «ЛЭТИ» совместно со специалистами Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера разработали экспресс-метод анализа инфекций, позволяющий осуществлять идентификацию микроорганизмов и тестирование их антибиотикорезистентности.

Целью разработки является конструирование портативного гибридного устройства для мультипараметрической экспресс-диагностики патогенных микроорганизмов, способного усовершенствовать по времени анализа и точности культуральный метод микробиологического анализа, включая идентификацию и тестирование чувствительности к антибиотикам.

«В настоящее время, из-за отсутствия информации об этиологии инфекционного процесса, в подавляющем большинстве случаев выбор антибактериальных препаратов проводится эмпирическим путем, без учета резистентности к ним возбудителя болезни. Это приводит к формированию в организме человека устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов, хронизации и носительству инфекций, инвалидности и даже гибели пациентов. Существующие методы in vitro диагностики инфекционных заболеваний централизованы, трудоемки и, что самое существенное, длительны и поэтому недостаточны для решения данной проблемы, непосредственно связанной с качеством и продолжительностью жизни населения», – рассказывает руководитель группы разработчиков, ведущий научный сотрудник Центра микротехнологии и диагностики СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Татьяна Михайловна Зимина.

Применяемый сегодня в медицине традиционный культуральный (т. е. основанный на росте культур микроорганизмов и приобретении ими видовых свойств) метод с использованием чашек Петри, несмотря на высокую достоверность, является длительным (4-6 суток) и трудоемким. Ученые Центра микротехнологии и диагностики СПбГЭТУ «ЛЭТИ» предложили решить проблему с помощью диагностического средства нового поколения.

В основу проекта заложена концепция миниатюризации традиционного культурального метода микробиологического исследования за счет использования технологий МЭМС/НЭМС и микрофлюидики.

Учеными разрабатывается портативная диагностическая система на основе одноразовых миниатюрных интегрированных диагностических платформ – «лабораторий-на-чипе» (ЛНЧ) размером 60 мм х 90 мм х 10 мм. В них интегрированы: миниатюрный ростовой модуль на основе нанопористой пластины из анодного оксида алюминия, для выращивания живых бактерий до состояния ювенильных колоний (до 1000 КОЕ), с возможностью их отсоединения и переноса в модуль идентификации; модуль идентификации, включающий элементы микрофлюидики, логики и сортировки на основе мультисенсорики и с возможностью выделения патогенов и переноса в модуль тестирования антибиотикорезистентности (АБР); модуль тестирования АБР выделенных патогенов с целью выбора эффективного антибактериального препарата и оптимального метода лечения заболевания.

«Использование миниатюрных платформ для культивирования ювенильных колоний патогенных микробных клеток позволяет обеспечить упорядоченный рост индивидуальных микроколоний, их автоматическое перемещение в смежные модули идентификации, сортировку и транспорт выделенных патогенов в ростовые модули для тестирования чувствительности к антибактериальным препаратам».

Ведущий научный сотрудник Центра микротехнологии и диагностики СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Татьяна Михайловна Зимина

Идентификация ювенильных колоний проводится в реальном масштабе времени. На низшем уровне с помощью регистрации сигналов сенсоров, включая КМОП сенсор и алгоритмы распознавания образов, оптический сенсор, импедансный сенсор и др. На высшем – с использованием алгоритмов вычисления оценок сходства распознаваемого и эталонных объектов по системе ансамблей признаков. Определение жизнеспособности микроколоний в модулях тестирования чувствительности к антибиотикам осуществляется методом многоканальной ближнепольной динамической турбидиметрии, методом измерения импеданса.

Основные технические и функциональные параметры диагностической системы: время анализа 6-8 часов; количество видов патогенов, выделяемых из одной пробы – 2-4; количество видов идентифицируемых патогенных и условно патогенных бактерий – 20; количество антибиотиков в одном тесте – не менее 10. Размер портативного прибора не превышает 100 мм х 150 мм х 200 мм.

«Использование микробиологической ЛНЧ позволяет радикально сократить время микробиологического анализа, повысить его точность и, благодаря портативности, сделать его децентрализованным и доступным для широкой врачебной практики. Это поможет врачу принять оперативное решение по эффективной антибактериальной терапии инфекционного заболевания, значительно сократив ее нежелательные последствия».

Ведущий научный сотрудник Центра микротехнологии и диагностики СПбГЭТУ «ЛЭТИ» Татьяна Михайловна Зимина

На сегодняшний день разработчиками определены основные параметры объектов экспресс-микробиологического анализа, создана библиотека визуальных образов микроколоний. Разработаны основные подсистемы и функциональные элементы одноразового гибридного устройства, включая предварительную обработку пробы, выращивание ювенильных колоний микроорганизмов, их транспорт и позиционирование, идентификацию, оценку жизнеспособности микроорганизмов при воздействии антибиотиков, обработку данных. Рассматриваются различные технологии интеграции устройства с использованием пленочных технологий и подходов гибкой электроники.

Учеными ЛЭТИ и Института Пастера получен патент на изобретение способа выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации. По оценке разработчиков, аналогов этому прибору на сегодняшний день в мире не существует.

Разработанное петербургскими учеными средство диагностики перспективно с точки зрения развития трансляционной медицины. В ближайшее время планируется воплощение разработки в промышленное производство.

Статьи

Питательные среды

Культивирование, дифференциация и выделение отдельных видов микроорганизмов стало возможным лишь с применением питательных сред. Это особые субстанции, которые создают благоприятные условия для размножения и роста определенного вида микробов и грибов, то есть чистых культур, что открывает возможность изучения их свойств и влияния на организм.

Сегодня питательные среды применяются как в медицине, так и в иных областях, например, в пищевой промышленности, где используются различные виды микроорганизмов для улучшения качества продуктов питания, увеличения срока годности, вкусовых и ароматических свойств. Так, чистые культуры, выделенные посредством использования питательных сред, применяются на хлебобулочных производствах, в винно-водочной промышленности, при создании сыров и молочных продуктов, для получения органических кислот, при квашении и консервации овощей и фруктов, в фармакологии.

Однако большая часть микробиологических исследований приходится на медицинский сектор. Именно поэтому основным покупателем субстратов являются клиники и лаборатории.

Компания БиоВитрум ведущий производитель и поставщик медицинского, диагностического и лабораторного оборудования, а также расходных материалов. Одно из направлений деятельности – это изготовление питательных сред для культивирования и выращивания микроорганизмов. Продукция компании производится из высококачественного сырья, которое содержит компоненты лошадиной и бараньей крови. Преимуществом, поставляемого из Великобритании исходного материала, являются особые условия, в которых выращивают животных. Их корма не содержат антибиотиков, что гарантирует стерильность питательных сред.

БиоВитрум предлагает купить питательные среды всех типов, которые соответствуют европейским стандартам.

Требования, предъявляемые к средам

Производимые сегодня субстраты, применяемые в целях культивирования, дифференциации и выделения микроорганизмов, должны соответствовать определенным показателям:

  • Питательность. Среда обладает жизненно важными для питания и удовлетворения энергетических потребностей, выращиваемых культур. А именно, содержит витамины, минеральные и органические (натуральные) вещества, микроэлементы, входящие в клеточный состав и активизирующие выработку ферментов и не вырабатываемые естественным путем аминокислоты.
  • Наличие водородных ионов. Поскольку микроорганизмы способны питаться только при условии проницаемости клеточной оболочки, то для ее обеспечения необходим оптимальный pH баланс.

Для патогенных микробов нужна слабощелочная питательная среда, для возбудителей туберкулеза пригодной является слабокислотная реакция.

  • Буферность среды. Это свойство обеспечивает стабильность pH баланса, нейтрализуя продукты распада.
  • Изотоничность – показатель давления внутри клетки и в среде, который должен находиться на одинаковом уровне для большинства микроорганизмов.
  • Стерильность среды. Важно исключить наличие посторонних микробов, которые способны оказать влияние на рост интересующей культуры.

Среды должны иметь влажность, поэтому плотные и сухие среды требуют предварительной подготовки. Среды должны обладать окислительно-восстановительными характеристиками, прозрачностью. Такой показатель, как унифицированность обеспечивает возможность выращивания различных микроорганизмов.

Классификация

Каждая культура нуждается в определенных условиях для обильного размножения клеток, их интенсивного роста и оптимального развития, поэтому сложно создать универсальную среду. Помимо этого, в зависимости от целей проводимых исследований, изменяются параметры питательной среды.

Сегодня созданы несколько разновидностей сред, отличающихся свойствами:

  • По составу исходных компонентов их классифицируют на синтетические и натуральные. Последние изготовляются из растительного либо животного сырья. Для снижения себестоимости используются непищевые продукты, например, костную муку или сгустки свернувшейся крови. Синтетические получают из органических, то есть натуральных и минеральных компонентов.
  • По консистенции Среды делятся на жидкие, плотные, полужидкие. Увеличение густоты осуществляется посредством добавления желатина или агар-агара. Последний ингредиент не является для микробов питательным веществом, его задача состоит в создании оптимальной плотности. При этом температура плавления агара достигает 80-100 градусов, что позволяет выращивать на средах с его содержанием микроорганизмы, нуждающиеся в создании парниковых условий. Желатин же представляет собой животный белок, поэтому субстраты с его содержанием можно применять в условиях комнатной температуры. К плотным субстанциям относят свернувшуюся сыворотку крови, яичный белок, картофель. Некоторые производятся в виде порошков и требуют перед употреблением растворения и доведения до нужной консистенции.
  • Состав питательных сред бывает простым и сложным. Первые представляют собой мясопептоидные бульоны, питательный желатин, пептоидные воды. Второй тип, кроме исходных компонентов, включает вещества, способствующие росту тех или иных бактерий. Существуют и специальные среды, используемые там, где не возможен рост бактерий на обычной субстанции.
  • Элективные питательные среды. Применяются для выделения конкретного типа бактерий за счет подавления роста других. Жидкие среды этой категории называют накопительными.
  • Дифференциально-диагностические среды используют для выделения одной культуры по ее ферментативной активности. Консервирующие субстраты используются при транспортировке материалов к месту исследования.
Читать еще:  Где выращивают хлопчатник и развито шелководство

Приготовление сред

От качества питательной среды зависит точность полученных результатов, поэтому кроме соблюдения рецептуры, необходимо придерживаться следующих требований:

  • Стерильность посуды. В производственных условиях, где изготовление осуществляется масштабно, варка сред проводится в специальных котлах. В лабораториях, когда необходимо получить небольшое количество питательных сред следует использовать эмалированную или стеклянную посуду, которая не выделяет кислоты и щелочи. Предварительно все резервуары моют, прополаскиваю и высушивают.
  • Ранее не использованная стеклянная посуда подвергает стерилизации в хлороводородистой кислоте, в которой оставляется на ночь, после чего прополаскивается в соответствии с установленным режимом.

Сам процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:

  • Варка, которая осуществляется либо на огне и водяной бане (для лабораторных условий), либо в котлах и автоклавах с подачей пара (в промышленных масштабах).
  • Установка оптимального pH соотношения требует использования бумажных индикаторов, потенциометров, стеклянных электродов.
  • Осветление осуществляется при помощи введения в субстрат, взбитого с водой, яичного белка или кровяной сыворотки, которые в процессе варки увлекают в осадок взвешенные частицы.
  • Фильтрации подвергаются жидкие среды, и на основе расплавленного желатина. Для этого используют тканевые и бумажные увлажненные фильтры. Существенно затрудняется очистка агаровых субстратов, поскольку основной компонент быстро застывает. Поэтому этот процесс чаще заменяется отстаиванием.
  • Стерилизация осуществляется для каждого субстрата в определенный промежуток времени и при необходимой температуре. Эти параметры указаны рецептуре приготовления.

Завершающим этапом является расфасовка питательных сред в посуду – это флаконы, пробирки, чашки Петри. Сосуд заполняется только на 2/3 поскольку при стерилизации среда увеличивается в объеме и может достичь пробки, что повлияет на чистоту и свойства субстрата.

Разливается продукт с использованием воронок, шприцев, пипеток или иных приспособлений.

Каждый сосуд маркируется. На сосуды наносится название продукта, указывается количество и дата производства.

Готовая среда проходит несколько ступеней контроля. Первые испытания на стерильность осуществляются путем помещения продукции в термостат.

Птательная среда отправляется в лаборатории для проведения химических испытаний, целью которого является установление точного pH уровня.

Проводится биологический контроль, который заключается в определении питательных качеств среды.

Виды питательных сред

По своему назначению производимые сегодня питательные составы среды можно разделить на следующие категории:

  • Универсальные среды. Они подходят для размножения различного типа культур.
  • Селективные или избирательные среды. Используются для выделения одного вида микроорганизмов.
  • Дифференциально-диагностические среды, которые открывают возможность отличить бактерии по их ферментативным свойствам, то есть продуктам жизнедеятельности.
  • Специальные среды. Применяются для выращивания тех культур, которые неспособны размножаться на универсальных субстратах.
  • Дифференциально-селективные средыиспользуются для оперативной идентификации бактерий.
  • Полусинтетические питательные составы среды, в состав которых вводят компоненты природного происхождения.

Компания БиоВитрум предлагает широкий ассортимент питательных сред, которые поставляют как во флаконах различного объема, так и в готовом виде в чашках Петри. Последние закупориваются специально разработанной целлюлозной пленкой, которая обеспечивает стерильность среды и срок годности, достигающий 60 дней.

Преимуществом компании БиоВитрум является оперативность поставок, конкурентоспособные цены, соответствие стандартам ГОСТ. Все питательные составы среды изготовляются на собственных мощностях, оснащенных высокотехнологичным оборудованием из сырья Oxoid LTD известного производителя Великобритании.

В компании БиоВитрум можно приобрести 18 наименований продуктов, представленных в каталоге, которые проходя многоступенчатый контроль. Продукция поставляется с полным комплектом документации и маркировкой на русском языке.

Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Жизнь организмов определяется температурой больше, чем каким-либо фактором внешней среды, в связи с тем, что все организмы построены из химических компонентов и все процессы жизни происходят на основе химических реакций, подчиненных законам термодинамики. Температура действует не только на скорость химических реакций, но также является причиной структурной перестройки протеинов, фазовых перемещений жиров, изменения структуры воды. Температурная амплитуда биохимической активности относительно мала в связи со специфическими свойствами биомолекул.
Витальная температурная зона, в пределах которой осуществляется активная жизнедеятельность микроорганизмов, за некоторым исключением, укладывается в рамки от 0 o до 50-60 o С. Нижняя граница активной жизнедеятельности микроорганизмов лимитируется, прежде всего, капельно-жидкой водой, постоянным потоком которой в клетке поддерживается трехмерность белковых молекул и других структурных носителей жизни и протекающие процессы ассимиляции и диссимиляции. Поэтому кристаллизация воды в омывающих жидкостях и клетках служит критическим порогом их жизни. Однако, если верхний порог витальной зоны, который определяется тепловой коагуляцией белков, довольно узок, то нижняя граница зоны жизнедеятельности более широка и «размыта», вследствие многих прямых и косвенных адаптаций к сохранению части воды в жидком состоянии, выработавшихся у организмов в процессе эволюции. Судя по многочисленным фактам выживания микроорганизмов после глубокого охлаждения, холод не нарушает органических соединений, и при нагревании микробные тела возвращаются к жизни.
По отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на мезофильные, психрофильные и термофильные (см.рис1). Деление бактерий на указанные группы довольно условно, так как температурные диапазоны их роста значительно перекрываются.

Большинство известных видов относится к мезофилам, у которых оптимальные температуры роста лежат между 3 o и 40 o , а температурный диапазон, в котором возможен рост находится между 10 и 45-50 o . типичным мезофилом является E. сoli: нижняя граница роста +10 o , верхняя +49 o , оптимальная температура +37 o при росте на богатой среде.
Психрофилы и факторы, определяющие возможнсоть роста при низких температурах. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от –10 до +20 o и выше. В свою очередь психрофилы делятся на облигатных и факультативных.
Основное различие между подгруппами заключается в том, что облигатные психрофилы не способны к росту при температуре выше 20 o 0 а верхняя температурная граница роста факультативных форм намного выше. Различаются они также и оптимальными температурными зонами роста, находящимися у облигатных психрофилов значительно ниже, чем у факультативных. Принципиальное же сходство между ними – способность к росту при 0 o и минусовых температурах.

Термофилы и механизм термофилии.

Группу термофилов делят на 4 подгруппы:

  1. Термотолерантные виды растут в пределах от 10 до 55 – 60 o , оптимальная область лежит при 35 — 40 o .
  2. Факультативные термофилы имеют максимальную температуру роста между 50 и 65 o , но способны также к размножению при комнатной температуре (20 o ). К облигатным термофилам относят виды, обнаруживающие способность расти при температурах около 70 o и не растущие ниже 40 o .
  3. Наконец, недавно обнаружены прокариоты, выделенные в подгруппу экстремальных термофилов. Для них характерны следующие температурные параметры: оптимум в области 80 –105 o , минимальная граница роста 60 o и выше, максимальная – до 110 o . К экстримальным термофилам относятся организмы из группы архебактерий, не имеющие аналогов среди мезофилов, например представители родов Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium и др.

Появились публикации об обнаружении бактерий, способных расти при температуре воды 250 – 300 o С и давлении 265 атм (при этом давлении вода в жидком состоянии может находиться до 460 o С). Эти бактерии выделены из проб воды поднятых с глубины 2560 м над поверхностью Тихого океана, где предположительно они существуют в горячих струях, выбрасываемых на дне океана так называемыми «черными гейзерами». Давление в районе обнаружения бактерий около 250 атм, а температура воды может быть выше 350 o С. В связи с этим исследователи начинают переоценивать границы условий, при которых способны развиваться прокариоты. Высказывается предположение, что прокариоты могут существовать везде, где есть вода в жидком состоянии и достаточное количество питательных веществ.
Высокая температура вызывает коагуляцию структурных белков и ферментов микроорганизмов. Большинство вегетативных форм гибнет при 60 o С в течение 30 мин, а при 80-100 o С – через 1мин. Для сохранения жизнеспособности относительно благоприятны низкие температуры (например, ниже 0 o С), безвредные для большинства микробов. Бактерии выживают при температуре ниже -100 o С; споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте. Простейшие и некоторые бактерии (спирохеты, риккетсии и хламидии) менее устойчивы к температурным воздействиям.
Воздействие высоких температур широко используется в лабораторной микробиологической практике. Стерилизация (sterilis –бесплодный) объектов проводится методами автоклавирования, кипячения, тиндализации, пастеризации, фламбирования, стерилизацией сухим жаром, паром без давления.
В хирургической практике стерилизуют инструменты, растворы, перевязочный материал.

Холодоустойчивость микроорганизмов

Роль факторов среды в процессах культивирования клеток.

Новые аппаратурные решения для контроля и управления процессом культивирования.

В настоящей статье рассмотрены вопросы влияния факторов среды на процессы культивирования клеток, приведен краткий обзор современных аппаратурных решений для контроля параметров питательной среды. Показано, что использование биотехнологических анализаторов позволяет более информативно изучать процессы культивирования микроорганизмов (клеток млекопитающих и др).

Введение

Важнейшей целью технолога при проектировании и эксплуатации ферментационного отделения любого биотехнологического производства является обеспечение максимально благоприятных условий для роста культуры, увеличения выхода целевого продукта. Это касается как поддержания заданной температуры процесса, уровня pH, так и состава и свойств питательной среды. Состав питательных сред должен в наибольшей мере соответствовать потребностям штамма-продуцента. В непрерывнодействующих процессах культивирования задача технолога сводится, в конечном итоге, к постоянному поддержанию необходимых концентраций питательных веществ (и кислорода) в ходе промышленной эксплуатации ферментера и дозированному введения кислоты/щелочи для pH-статирования. Более сложные проблемы возникают при производстве метаболитов, когда в ходе периодического процесса культивирования состав среды, окружающей клетки штамма-продуцента, должен изменяться в зависимости от фазы роста культуры, ее состояния и уровня активности. Именно это обстоятельство затрудняет перевод такого рода производств на непрерывный режим эксплуатации, да и при периодическом режиме требует от обслуживающего персонала постоянного контроля и управления процессом.

Для решения этих задач современный этап развития промышленной биотехнологии требует надежных экспресс-методов количественного изучения свойств живых клеток как продуцента целевого продукта, а также концентрации питательных веществ и метаболитов. В последние годы разрабатываются и внедряются новые аппаратурные решения для всестороннего экспресс-контроля культуры и питательной серды. Относительно новым классом подобных приборов являются биотехнологические анализаторы, с помощью которых можно получать данные о концентрации питательных веществ и метаболитов в культуральной среде в режиме онлайн. Принцип работы таких анализаторов основан на биосенсорных технологиях, использование которых позволяет получать точные воспроизводимые результаты в течение 1-2 мин.

Обзор основных факторов культуральной среды и их роли в процессе культивирования

В таблице 1 приведены факторы культуральной среды, которые определяют рост и биосинтетическую активность продуцентов. Рассмотрим данные факторы и методы управления ими более подробно.

Состав и концентрация питательных веществ определяют метаболизм клеток-продуцентов. В зависимости от типа процесса в качестве таких веществ могут выступать глюкоза, сахароза, лактоза, ксилоза, крахмал, целлюлоза, этанол и др. Состав питательных веществ определяется на этапе составления композиции питательной среды, а концентрация может поддерживаться или меняться в ходе ферментации в зависимости от способа.

При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт. Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).

При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами. В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Продукты метаболизма (например, лактата или аммиака) и ингибиторы замедляют биохимические реакции, а следовательно, и в целом процесс ферментации. Такие вещества следует выводить из среды ферментации. Для этой цели в настоящий момент могут быть использованы ряд инструментальных решений, например, ротационный фильтр. (Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы.)

Значение pH и температуры регулируют скорость биохимических реакций. Кислотность питательной среды особое значение имеет для биохимических реакций, протекающих в клетках-продуцентах. Концентрация в растворе ионов водорода оказывает влияние на физико-химические свойства и биологическую активность белков и нуклеиновых кислот, поэтому для оптимального протекания культивирования поддержание кислотно-основного гомеостаза является задачей исключительной важности. В ферментере постоянное значение pH поддерживается путем дозирования щелочи/кислоты. В зависимости от природы продуцента оптимальный диапазон значения pH могут различаться. Например, при культивировании большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8).

Задача термостатирования, то есть поддержания постоянной температуры процесса в диапазоне 2-3 градусов, аппаратурно решается с помощью термостатирующих рубашек (водяных, воздушных и др). Например, оптимальная температура культивирования клеток млекопитающих составляет составляет +36-37 градусов, насекомых +20-25 градусов.

Осмотическое давление является важнейшим физиологическим параметром, в ходе культивирования оно поддерживается с помощью разбавления или добавления новых порций среды. Величина осмотического давления питательных сред в основном зависит от концентрации NaCl, оптимальное значение при +38 градусов составляет 7,6 атм.

Технологическое оформление биотехнологических процессов в сильной степени определяется отношение микроорганизма – продуцента к кислороду. Культуры бывают как аэробные, так и анаэробные. В первом случае кислород обеспечивает метаболизм. Анаэробная ферментация может проводиться в условиях полной защиты культуральной среды от кислорода (если микроорганизмы являются облигатными анаэробами) или просто без подачи дополнительной кислородной смеси.

Углекислый газ служит источником углерода для автотрофов. Некоторые гетеротрофные микроорганизмы нуждаются в нем, а некоторые наоборот замедляют метаболизм в присутствии СО2. Поэтому концентрация углекислого газа во многих случаях является важным параметром процесса ферментации.

Конструкция мешалки ферментера, а также скорость ее вращения регулирует процессы массопереноса, трансфера питательных веществ к продуцентам и отвода метаболитов.

Таблица1. Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов.

Возможности современных ферментеров для контроля и управления факторами среды. Биотехнологические анализаторы

Читать еще:  Как в домашних условиях выращивать гиацинты в?

Ферментер (биореактор) занимает ключевое место в аппаратурном оформлении биотехнологического процесса. Он представляет собой аппарат для глубинного выращивания (культивирования) микроорганизмов (или культур клеток) в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной температуры.

Современные ферментационные аппараты позволяют контролировать и управлять процессом культивирования клеток и добиваться высоких результатов в получении целевого продукта. Однако даже самый современный ферментер не позволит технологу контролировать и управлять всеми факторами среды (см. табл. 1). Во многих случаях технолог или оператор ферментационного отделения вынужден использовать рутинные методики для определения, например, концентрации метаболитов или питательных веществ. В качестве альтернативы рутинным методикам в последнее время широкое распространение получили биотехнологические анализаторы. Их работа основана на использовании биосенсоров, время выполнения анализа составляет 1-2 мин.

Данные о биотехнологическом процессе, полученные с помощью ферментера и биотехнологического анализатора, являются мощным инструментом для управления ферментацией в непрерывном и периодических режимах. В таблице 2 обобщены аппаратурные методы управления факторами среды при использовании ферментера в комплекте с анализатором. При этом в таблице использованы данные о характеристиках анализатора Bioprfile FLEX как самого современного и мощного биотехнологического анализатора на настоящий момент, который способен заменить несколько отдельных приборов или рутинных методик. Bioprofile FLEX позволяет оператору в экспресс-режиме измерять концентрации питательных веществ, метаболитов, осмотическое давление, а также измерять физиологический статус продуцента. Кроме того анализатор может быть интегрирован в контроллер ферментера, а управление подпиткой автоматизировано.

В многочисленных опубликованных статьях описано успешное использование анализаторов Bioprofile или аналогов для решения задач составления оптимальных сред, оптимизации подпитки, увеличения выхода целевого продукта и др. Поэтому использование биотехнологических анализаторов на производствах и в лабораториях является стандартным и доказано эффективным.

Таблица 2. Основные факторы среды, определяющие рост и биосинтетическую активность продуцентов, аппаратурные способы контроля и управления ими.

Выводы

  • При непрерывном и периодическом культивировании актуальна задача экспресс-контроля концентрации питательных веществ и метаболитов в культуральной среде, оценки физиологического состояния продуцента.
  • Современные ферментеры позволяют контролировать и управлять основными параметрами культуральной среды, но только с их применение невозможно решить задачу оперативного контроля концентрации питательных веществ и метаболитов, а также изучения физиологического статуса продуцента.
  • Использование технологом/оператором биотехнологического производства анализаторов Bioprofile FLEX или аналогов является эффективным и надежным экспресс-инструментом количественного изучения свойств продуцента, концентрации питательных веществ и метаболитов.

Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

1 Институт общей физики имени А. М. Прохорова РАН, Москва

2 Кафедра лазерных микро- и нанотехнологий, Инженерно-физический институт биомедицины, Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Москва

3 Лаборатория генной инженерии патогенных микроорганизмов, Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва

4 Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей, Москва

Для корреспонденции: Геннадий Александрович Меерович
ул. Вавилова, д. 38, г. Москва, 119991;

  • РЕФЕРАТ
  • ПОЛНЫЙ ТЕКСТ
  • РИСУНКИ И ТАБЛИЦЫ
  • ЛИТЕРАТУРА
  • ПРИЛОЖЕНИЕ

Антибактериальная фотодинамическая терапия (АФДТ) является перспективным способом лечения локальных инфицированных очагов, в частности хирургических и ожоговых ран, трофических и диабетических язв [1, 2]. При АФДТ в отличие от антибиотикотерапии разрушение бактериальных клеток происходит без развития резистентности в ответ на лечение [3–6]. Большинство патогенных микроорганизмов, в том числе устойчивые к антибиотикам штаммы бактерий, восприимчиво к АФДТ [7].
В локальных инфицированных очагах, в частности инфицированных ранах, наиболее часто обнаруживаются грамположительные бактерии Staphylococcus aureus (S. aureus), грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) и Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), штаммы которых могут обладать множественной антибиотикорезистентностью, приводить к переходу процесса в хроническое состояние и различным опасным последствиям для пациентов [8].

Грамположительные и грамотрицательные бактерии имеют принципиальные различия в своем строении и чувствительности к лекарственному воздействию. Клеточная стенка грамположительных бактерий не оказывает существенного влияния на проникновение в них большинства фотосенсибилизаторов (ФС). У грамотрицательных бактерий она обладает дополнительным структурным элементом — наружной мембраной толщиной 10–15 нм, имеющей гетерогенный состав (белки с пориновой функцией, липополисахаридные тримеры и липопротеины, создающие внешнюю псевдоповерхность плотно упакованных отрицательных зарядов) [9–11]. Такая система препятствует проникновению гуморальных защитных факторов организма и является причиной устойчивости ко многим лекарственным препаратам: через пориновые каналы диффундируют только относительно гидрофильные соединения с молекулярной массой ниже 700 Да, а при увеличении размеров и массы молекул вероятность их диффузии внутрь грамотрицательных бактерий снижается. С грамотрицательными бактериями эффективно взаимодействуют только катионные ФС [10, 11]. Дополнительным преимуществом катионных ФС может быть возможность использования для сенсибилизации их высококонцентрированных водных композиций (растворов или нанодисперсий), поскольку кулоновское отталкивание молекул катионных бактериохлоринов может частично уменьшить их агрегацию [12], снижающую эффективность фотодинамических процессов.

При выборе ФС для АФДТ необходимо иметь в виду, что глубина очагов инфекционного поражения некоторыми бактериями, например P. аeruginosa, может достигать 12–15 мм [13], делая неэффективным применение как обычных аппликационных антибактериальных средств (растворов, мазей, гелей), так и ФС, проявляющих фототоксичность при возбуждении в видимом диапазоне спектра. Поэтому для надлежащего фотодинамического воздействия на такие очаги необходимо использовать для АФДТ ФС ближнего инфракрасного диапазона, возбуждение которых осуществляется в «спектральном окне прозрачности биологической ткани» (720–850 нм). В связи с этим в качестве ФС для АФДТ активно исследуют катионные производные бактериохлоринов. Исследования, проведенные на поликатионных производных синтетических бактериохлоринов с молекулярной массой 1500–1800 Да, показали, что эти ФС обеспечивают инактивацию как грамположительных бактерий S. aureus, так и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa, однако значения минимальной бактерицидной концентрации при использовании этих ФС достаточно высоки (> 6 мкМ на S. aureus, около 25 мкМ на P. aeruginosa) [14].

Задача повышения эффективности антибактериальной ФДТ делает актуальными создание и исследование ФС на основе поликатионных синтетических бактериохлоринов с уменьшенными размером молекулы и молекулярной массой. Целью работы было изучить в широком диапазоне концентраций фотофизические и антибактериальные свойства наноструктурированного ФС на основе тетракатионного амфифильного производного синтетического бактериохлорина мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил)бактерио-хлорина тетрабромида 3-Py4BСHp4Br4.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тетракатионное амфифильное производное синтетического бактериохлорина — мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил) бактериохлорина) тетрабромид 3-Py4BСHp4Br4 — обладает меньшей степенью липофильности и меньшим радиусом молекулы по сравнению с производным, описанным ранее [14]. Оно было синтезировано алкилированием мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина бромистым гептилом в нитрометане в инертной атмосфере. Наноструктурированную дисперсию 3-Py4BСHp4Br4 получили путем его солюбилизации в 4%-й дисперсии Kolliphor ELP (BASF; Германия). Гидродинамический размер наночастиц, по результатам измерений на приборе Zetasizer Nano Series ZS 3600 (Malvern Panalitical; Великобритания), лежит в пределах 12–14 нм.

Поглощение ФС в диапазоне концентраций 0,001–0,1 мМ изучали на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3410 (Hitachi; Япония), а спектрально-флуоресцентные исследования проводили с использованием спектроанализатора ЛЭСА-01-Биоспек (ООО БИОСПЕК; Россия). Флуоресценцию возбуждали лазерным излучением с длиной волны 532 нм, попадающей в Q2-полосу производного бактериохлорина. Для изучения особенностей формы спектральной полосы спектрально-флуоресцентные исследования ФС проводили в кюветах разной длины (1 мм и 10 мм), а спектральную интенсивность флуоресценции дополнительно нормировали на интенсивность флуоресценции в спектральном максимуме ее полосы (приводили спектральный максимум к 1). Это позволило при анализе спектров разделить изменения, связанные с перепоглощением и агрегацией.

Для измерения времени жизни люминесценции водных композиций исследуемых ФС использовали спектрометр с время-разрешающей регистрацией. Спектрометр включал в себя пикосекундный импульсный лазерный источник с оптоволоконным выходом Picosecond Light Pulser PLP-10 (Hamamatsu; Япония), генерирующий импульсное лазерное излучение с длиной волны 637 нм и длительностью импульса 65 пс, полихроматор Jarrell-Ash (Division of Fisher Co; США) с оптоволоконным входом и оптическим фильтром Semrock LD01-785/10-12.5 (Semrock Inc; США) на входе, который пропускал только спектральную область полосы люминесценции производных бактериохлоринов и минимизировал влияние сторонних засветок. Полученный сигнал аппроксимировали суммой нескольких экспонент.
Изучение фотоинактивации планктонных бактерий проводили на клинических изолятах S. aureus 15, P. aeruginosa 32, K. pneumoniae 1556. Бактерии выращивали в питательном бульоне LB или на 1%-м агаре LB (Difco; США). Для планктонных культур определяли минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) ФС в стандартных условиях: инкубация бактерий с ФС в течение 30 мин, плотность дозы облучения — 20 Дж/см 2 .
Исходный титр бактерий составляли 1 • 10 8 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в миллилитре). Использовали двукратные разведения ФС, начиная с 1 мМ. После инкубации бактериальную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 7000 об./мин на лабораторной центрифуге Eppendorf (Eppendorf; Германия), ФС удаляли, бактерии ресуспендировали в физиологическом растворе, суспензии каждой концентрации (а также контроль без ФС) разливали по 100 мкл в лунки двух 96-луночных плоскодонных планшетов. Один из них был предназначен для опыта с облучением, другой для контроля без облучения.
Для облучения использовали светодиодный источник СФД-М-760 (АНО «МИКЭЛ»; Россия) с длиной волны спектрального максимума 760 нм и полушириной спектральной полосы, равной примерно 35 нм. Плотность мощности составляла 22–25 мВт/см2, длительность облучения — 20 мин. Для контроля плотности мощности использовали измеритель Coherent labmax (Coherent; США) с диафрагмой.
После облучения 50 мкл из каждой лунки высевали на чашки Петри с агаром LB, инкубировали в темноте при 37 °С в течение 20 ч. Отмечали наименьшую концентрацию ФС, высев из которой не давал роста. Эту концентрацию принимали за МБК.

Изучение зависимости поглощения 3-Py4BСHp4Br4 от его концентрации в нанодисперсии проводили для оценки выраженности агрегационных процессов. Рабочая полоса поглощения 3-Py4BСHp4Br4 имеет узкий спектральный контур (полуширина составляет примерно 22 нм) с максимумом около 760 нм. Исследования показали, что в отличие от поликатионных фталоцианинов признаки агрегации в спектрах поглощения дисперсии 3-Py4BСHp4Br4 не выражены [15]: форма спектра поглощения не изменяется при увеличении концентрации; зависимость оптической плотности от молярной концентрации линейна (выполняется закон Бугера) и согласуется со значениями экстинкции, определенными при низких концентрациях (Рис. 1. Зависимость поглощения дисперсии 3-Py4BСHp4Br4 в 4%-м Kolliphor ELP от ее концентрации» data-note=»» >рис. 1).
Для подтверждения высказанного предположения о невысокой степени агрегации изучаемого ФС проводили спектрально-флуоресцентные исследования его нанодисперсии. Изучали форму и интенсивность спектров флуоресценции, а также излучательное время жизни возбужденного состояния 3-Py4BСHp4Br4 при высоких и низких значениях концентрации.
Анализ приведенных спектров флуоресценции ФС показывает, что увеличение длины кюветы от 1 до 10 мм при низких (0,005 мМ) значениях концентрации не влияет на форму спектрального контура (Рис. 2. Приведенные спектры флуоресценции дисперсий 3-Py4BСHp4Br4 разной концентрации (спектры 1,2 — 0,005 мМ; спектры 3,4 — 0,05 мМ) при исследованиях в кюветах разной длины (спектры 1, 3 — 1 мм; спектры 2, 4 — 10 мм)» data-note=»» >рис. 2, спектры 1, 2), приводя только к незначительному (на 0,3 нм) сдвигу спектрального максимума из-за перепоглощения. При этом полоса флуоресценции остается узкой (27 нм).
При высоких (0,05 мМ) значениях концентрации, примерно соответствующих концентрации ФС в плазме крови через 1 ч после внутривенного введения, из-за перепоглощения происходит длинноволновое смещение спектрального максимума полосы флуоресценции, зависящее от длины кюветы (на 1,5 нм — в кювете длиной 1 мм и на 3,4 нм — в кювете длиной 10 мм). При этом увеличивается и полуширина полосы флуоресценции (в кювете 1 мм — на 1,1 нм, а в кювете 10 мм — на 4,3 нм), но форма спектрального контура не меняется, в нем не появляются дополнительные батохромно и гипсохромно сдвинутые пики.
Исследование излучательного времени жизни с использованием ранее описанного подхода [16] показало наличие двух компонент. Доминирующей при исследованиях в воде является компонента со средним значением времени жизни, равным 2,8 нс, доля которой составляет примерно 86%. В плазме крови, где агрегация снижается, доминирующая компонента со средним значением времени жизни, равным около 2,9 нс, составляет почти 100%.
Зависимость интегральной интенсивности флуоресценции дисперсии от концентрации ФС близка к линейной до 0,03 мМ (Рис. 3. Зависимость интегральной интенсивности флуоресценции водных композиций 3-Py4BСHp4Br4 от их молярной концентрации: 1 — в воде; 2 — в плазме крови» data-note=»» >рис. 3), а при более высоких концентрациях становится сублинейной. Такая же зависимость наблюдается для композиции 3-Py4BСHp4Br4 в плазме крови. При этом форма кривых почти не изменяется, хотя интенсивность флуоресценции в плазме крови выше по сравнению с интенсивностью флуоресценции в воде в 1,3–1,4 раза.
Результаты определения МБК 3-Py4BСHp4Br4 в стандартных условиях представлены в Таблица. Значения МБК для 3-Py4BСHp4Br4 в стандартных условиях (время инкубации — 0,5 ч, доза облучения — 20 Дж/см 2 )» data-note=»» >таблица.

Результаты исследования поглощения ФС свидетельствуют о невысокой степени их агрегации в изучаемом диапазоне концентраций [15], поскольку во всем диапазоне его концентраций форма и полуширина спектра полосы поглощения не изменяются, а поглощение линейно зависит от концентрации.
Анализ особенностей изменения формы спектральной полосы флуоресценции при увеличении концентрации и длины кюветы позволяет предположить, что наблюдаемые явления, происходящие при высокой концентрации изучаемого ФС, связаны преимущественно с перепоглощением; при этом имеет место и агрегация, но вклад ее незначителен. Об этом же свидетельствуют результаты изучения излучательного времени жизни возбужденного состояния ФС на основе 3-Py4BСHp4Br4 и зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации 3-Py4BСHp4Br4 в дисперсии, особенно в плазме крови [17–21].
Эти данные позволяют сделать вывод, что эффективность фотодинамических процессов при высоких концентрациях 3-Py4BСHp4Br4 не будет снижаться и дает возможность использовать нанодисперсии 3-Py4BСHp4Br4 с такими концентрациями для сенсибилизации при АФДТ.
По сравнению с ФС на основе катионных бактериохлоринов, описанных ранее [14], 3-Py4BСHp4Br4 имеет значительно более низкие значения МБК для грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa в планктонном состоянии. Низкие значения МБК получены также для грамотрицательных бактерий K. pneumoniae.

Результаты исследований показывают, что исследуемый тетракатионный ФС на основе синтетического амфифильного производного бактериохлорина 3-Py4BСHp4Br4 с уменьшенными размером молекулы и молекулярной массой обладает высокой эффективностью фотодинамической инактивации грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa и K. pneumoniae. Исследования фотофизических свойств ФС в широком диапазоне концентраций продемонстрировали его низкую агрегацию в воде и плазме крови. Результаты исследований позволяют сделать вывод, что ФС на основе наноструктурированной формы 3-Py4BСHp4Br4 перспективен для фотодинамического лечения локальных инфицированных очагов, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями.

Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Кишечная инфекция острая


Кишечные инфекции – одно из самых распространенных заболеваний в мире. Распространенность их среди населения чрезвычайно высокая, как в детской возрастной группе, так и у взрослых. Когда мы говорим о кишечной инфекции, то подразумеваем острое кишечное заболевание.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) – группа острых инфекционных заболеваний человека, вызываемых различными инфекционными агентами (преимущественно бактериями), с алиментарным механизмом заражения, проявляющиеся лихорадкой и кишечным синдромом с возможным развитием обезвоживания и тяжелым течением в детской возрастной группе и у пожилых людей.

Заболеваемость кишечными инфекциями в мире, и в частности в России, достаточно высока. Ежегодно на планете заболевают более 500 млн. человек. Показатель заболеваемости в России доходит до 400 и более случаев на 100 тыс. населения. Структура детской заболеваемости и летальности позволяет говорить о третьем месте именно острых кишечных заболеваний.

Читать еще:  Какие ягоды можно выращивать в домашних условиях?

Причины кишечных инфекций

Пищеварительный тракт состоит из ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, тонкого кишечника (включающего 12-типерстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку), толстого кишечника. В слюне ротовой полости присутствует вещество – лизоцим, обладающее бактериостатическим действием. Это первый защитный барьер. Слизистая оболочка желудка имеет железы, вырабатывающие желудочный сок (состоящий из соляной кислоты и пепсина). Соляная кислота является вторым барьером для патогенных микроорганизмов, который могут в нем погибнуть (однако это происходит не всегда). Слизистая тонкого кишечника покрыта многочисленными ворсинками, участвующими в пристеночном пищеварении, выполняющими защитную и транспортную функции.
Микрофлора, населяющая кишечник — бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки, бактероиды, фузобактерии, пептококки. Облигатная флора составляет 95-98% от всех представителей. Другая группа микроорганизмов, населяющих кишечник, к которой относятся стафилококки, грибы, условно-патогенные микроорганизмы (клебсиеллы, стрептококки, протей, синегнойная палочка, клостридии и другие). Вся остальная флора, попадающая извне, называется патогенной и вызывает острую кишечную инфекцию.

Причины возникновения кишечных инфекций


Источник инфекции – больной клинически выраженной или стертой формой кишечной инфекции, а также носитель. Заразный период с момента возникновения первых симптомов болезни и весь период симптомов, а при вирусной инфекции – до 2х недель после выздоровления. Больные выделяют возбудителей в окружающую среду с испражнениями, рвотными массами, реже с мочой.

Механизм заражения – алиментарный (то есть через рот). Пути инфицирования – фекально-оральный (пищевой или водный), бытовой, а при некоторых вирусных инфекциях – воздушно-капельный. Большинство возбудителей острой кишечной инфекции высокоустойчивы во внешней среде, хорошо сохраняют свои патогенные свойства на холоде (в холодильнике, например). Факторы передачи – пищевые продукты (вода, молоко, яйца, торты, мясо в зависимости от вида кишечной инфекции), предметы обихода (посуда, полотенца, грязные руки, игрушки, дверные ручки), купание в открытых водоемах. Основное место в распространении инфекции отводится соблюдению или не соблюдению норм личной гигиены (мытье рук после туалета, ухода за больным, перед едой, дезинфекция предметов обихода, выделение личной посуды и полотенца заболевшему, сокращение контактов до минимума).
Восприимчивость к кишечным инфекциям всеобщая независимо от возраста и пола. Наиболее восприимчивы к кишечным патогенам – дети и лица преклонного возраста, лица с заболеваниями желудка и кишечника, люди, страдающие алкоголизмом.

Общие симптомы острых кишечных инфекций

Инкубационный период (с момента попадания возбудителя до появления первых признаков болезни) длится от 6 часов до 2х суток, реже дольше.
Для практически любой кишечной инфекции характерно развитие 2х основных синдромов, но в различной степени выраженности:

  1. Инфекционно-токсического синдрома (ИТС), который проявляется температурой от субфебрильных цифр (37º и выше) до фебрильной лихорадки (38° и выше). При некоторых инфекциях температуры нет совсем (например, холера), также отсутствие температуры или небольшой кратковременный подъем характерен для пищевого отравления (стафилококкового, например). Температура может сопровождаться симптомами интоксикации (слабость, головокружение, ломота в теле, подташнивание, иногда на фоне высокой температуры рвота). Часто инфекционно-токсический синдом является началом острой кишечной инфекции длится до появления второго синдрома от нескольких часов до суток, реже дольше.
  2. Кишечного синдрома. Проявления кишечного синдрома могут быть разными, но есть схожесть симптоматики. Этот синдром может проявляться в виде синдрома гастрита, гастроэнтерита, энтерита, гастроэнтероколита, энтероколита, колита.

Синдром гастрита характеризуется появлением болей в области желудка (эпигастрии), постоянной тошноты, рвоты после приема пищи и питья воды, причем ее может вызвать даже глоток жидкости. Рвота может быть многократной, приносящей недолговременное облегчение. Возможно разжижение стула и в течение короткого промежутка времени, иногда однократно.

Синдром гастроэнтерита сопровождается болями в животе в области желудка и околопупочной области, рвотой, появлением частого стула сначала кашицеобразного характера, а затем с водянистым компонентом. В зависимости от причины возникновения в стуле может меняться цвет (зеленоватый при сальмонеллезе, светло-коричневый при эшерихиозе, к примеру), а также появляться слизь, непереваренные остатки пищи.

Синдром энтерита характеризуется появлением только нарушений стула в виде частого водянистого стула. Частота зависит от вида возбудителя и степени инфицирующей дозы его, попавшей к конкретному больному.

Синдром гастроэнтероколита проявляется и рвотой, и частым жидким стулом, боли в животе становятся разлитого характера и практически постоянными, акты дефекации становятся болезненными, не приносящими облегчения, нередко примеси крови и слизи в стуле. Некоторые акты дефекации со скудным слизистым отделяемым.

Синдром энтероколита характеризуется только выраженным болевым синдромом по всему периметру живота, частым стулом вперемешку со скудным отделяемым.

Синдром колита проявляется болями в нижних отделах живота, преимущественно слева, акты дефекации болезненные, содержимое скудное с примесью слизи и крови, ложные позывы на стул, отсутствие облегчения в конце дефекации.

Такие синдромы как гастроэнтерит, гастроэнтероколит и энтероколит характерны для сальмонеллеза, энтероколит и колит – для дизентерии, эшерихиозы сопровождаются развитием гастроэнтерита, энтерит – ведущий синдром холеры, синдром гастрита может сопровождать пищевое отравление, однако это может быть и гастроэнтерит, вирусные кишечные инфекции протекают чаще в виде гастроэнтеритов.

Осложнения острых кишечных инфекций

  1. Дегидратация (обезвоживание) – патологическая потеря воды и солей неестественным путем (рвота, жидкий стул). Выделяют 4 степени обезвоженности у взрослых:
    — 1 степень (компенсированная) – потеря массы тела до 3% от исходной; 2 степень(переходная) – потеря массы тела 4-6% от исходной; 3 степень(субкомпенсированная) – 7-9% от исходной; 4 степень (декмпенчированная) – более 10% потери массы тела от исходной.
    У детей 3 степени: 1 степень (потери массы до 5% от исходной), 2 степень (6-9%), 3 степень (алгид) – более 10% потерь массы тела от исходной.
    Помимо снижения веса беспокоит сухость кожи и слизистых, жажда, снижение эластичности кожи, нарушения гемодинамики (учащение пульсы, снижение АД). Жажда бывает невсегда: если имеет место соледефицитный тип обезвоживания (это случается чаще при многократной рвоте), то жажды может и не быть. Если же вододефицитный тип дегидратации, то жажда – основной симптом.
  2. Одно из проявлений молниеносной дегидратации: дегидратационный шок с возможным летальным исходом. Имеет место глубокое обезвоживание и расстройства гемодинамики (критическое падение артериального давления).
  3. Инфекционно-токсический шок: возникает на фоне высокой температуры, чаще в начале болезни и сопровождается высокой токсинемией (высокой концентрацией токсинов бактерий в крови), серьезными нарушениями гемодинамики и возможным летальным исходом.
  4. Пневмония (воспаление легких).
  5. Острая почечная недостаточность.

Не секрет, что появление частого жидкого стула для большинства людей – не повод для обращения к врачу. Большинство стараются различными препаратами и методами остановить диарею и восстановить нарушенное состояние здоровья. Вместе с тем, простая (как кажется на первый взгляд) кишечная инфекция может обернуться серьезной проблемой с длительной потерей трудоспособности.

Симптомы, с которыми нужно обратиться к врачу незамедлительно:

  1. ранний детский возраст (до 3х лет) и дошкольный возраст ребенка;
  2. лица преклонного возраста (старше 65 лет);
  3. частый жидкий стул более 5 раз в сутки у взрослого;
  4. многократная рвота;
  5. высокая лихорадка с диареей и рвотой;
  6. кровь в стуле;
  7. схваткообразные боли в животе любой локализации;
  8. выраженная слабость и жажда;
  9. наличие хронических сопутствующих болезней.

Что нельзя категорически делать при подозрении на острую кишечную инфекцию:
Если появился частый жидкий стул, сопровождаемой болями в животе и температурой, то:

  1. Нельзя применять болеутоляющие лекарственные средства. В случае скрытых симптомов какой-либо хирургической патологии (холецистит, аппендицит, кишечная непроходимость и другие) снятие болевого синдрома может затруднить постановку диагноза и отложить оказание своевременной специализированной помощи.
  2. Нельзя самостоятельно применять закрепляющие средства (вяжущие) – такие как иммодиум или лоперамид, лопедиум и другие. При острой кишечной инфекции основная масса токсинов возбудителей концентрируется в кишечнике, и применение таких препаратов способствует их накоплению, что усугубит состояние пациента. Течение кишечной инфекции будет благоприятным при своевременном опорожнении содержимого кишечника вместе с токсинами патогенов.
  3. Нельзя делать самостоятельно клизмы, особенно с горячей водой.
  4. Нельзя применять греющие процедуры на живот (грелка с горячей водой, например), что безусловно способствует усилению воспалительного процесса, что усугубит состояние пациента.
  5. При наличии симптомов острой кишечной инфекции и подозрении на хирургическую патологию нельзя медлить и пытаться лечить подручными средствами (народные, гомеопатические и другие). Последствия промедления с обращением за медицинской помощью могут быть очень печальными.

Лабораторная диагностика острой кишечной инфекции


Предварительный диагноз выставляется после клинико-эпидемиологического обследования, которое включает в себя контакт с больным, возможные случаи кишечной инфекции среди ближайшего окружения, употребление в пищу недоброкачественных продуктов, продуктов без водной обработки и термической обработки, несоблюдение правил личной гигиены, а также по симптомам заболевания (начало болезни, основные симптомы, характерные для той или иной инфекции).

Уже на данной стадии возможно безошибочное определение диагноза (например, при вспышечном характере болезни и наличии подобных больных в инфекционной клинике, при наличии специфических симптомов – кровь в стуле, ложные позывы на стул, температура при дизентерии, например; обильный водянистый стул без запаха и примесей, без температуры – при холере), в силу чего в некоторых случаях после забора всех материалов для лабораторного исследования назначается специфическое лечение уже на стадии предварительного диагноза.
Опытный доктор при наличии очевидной симптоматики может заподозрить определенную кишечную инфекцию и назначить адекватное лечение.

Окончательный диагноз выставляется после лабораторного подтверждения:

  1. Бактериологические методы (посев материалов для исследования на специальные среды и выращивание колоний бактерий). Материалами могут быть испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищи, пробы воды. Предварительный высев и результат может быть выдан на 2е-3и сутки.
  2. Серологические методы (обнаружение специфических антител в крови) ИФА, РНГА – берутся обязательно парные сыворотки крови с интервалом в 10-14 дней.
  3. ПЦР диагностика в биологических жидкостях (например, L-формы сальмонелл). Результат выдается в тот же день.

Инструментальные методы диагностики: ректороманоскопия, колоноскопия, иригоскопия.

Прогноз острой кишечной инфекции

Исходами могут быть как благоприятный исход (выздоровление), так и неблагоприятные (формирование хронических форм, носительства). В детской возрастной группе исходами кишечной инфекции могут быть в 25% случаев формирование патологии желудочно-кишечного тракта в виде нарушений функции поджелудочной железы, расстройств желчевыводящих путей, дисбактериоза кишечника, функциональной диспепсии.

Профилактика острой кишечной инфекции сводится к следующим мероприятиям:

  1. соблюдение правил личной гигиены;
  2. употребление кипяченой, бутилированной воды;
  3. мытье овощей, фруктов перед употреблением проточной водой, а для маленьких детей – кипяченой;
  4. тщательная термическая обработка необходимой пищи перед употреблением;
  5. краткосрочное хранение скоропортящихся продуктов в холодильнике;
  6. не скапливать мусор;
  7. следить за поддержанием чистоты в жилище и санитарное содержание туалетной комнаты и ванной.

Большинство патогенных микроорганизмов выращивают

Диагностика инфекций
Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.

Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.

Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов.

Они включают:

  • микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
  • выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
  • идентификацию бактерий;
  • определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.

Иммунология
Иммунологический анализ крови – это метод лабораторного исследования, позволяющий оценить состояние общего иммунитета, его напряженность, то есть насколько защитная система организма задействована в момент анализа, определить количество и функцию иммунных клеток крови, присутствие в ней антител. Иммунологический анализ способен выявить первичный и вторичный иммунодефициты, помочь при диагностике аутоиммунных, гематологических, инфекционных и лимфопролиферативных заболеваний.

Иммунологическое исследование проводится:

  • в случае повторяющихся инфекционных заболеваний;
  • в случае если инфекционное заболевание носит тяжёлый и затяжной характер;
  • при подозрениях на врожденный или приобретенный иммунодефицит;
  • при подозрении на аутоиммунное заболевание;
  • при аллергических реакциях;
  • перед серьёзными хирургическими вмешательствами;
  • в случае, если послеоперационный период протекает с осложнениями;
  • в целях контроля за ходом лечения некоторыми группами медикаментов (иммунодепрессантами, иммуномодуляторами и т.п.).

Интерпретация результатов производится врачом-иммунологом, который учитывает данные осмотра, жалобы пациента и результаты других исследований. Наибольшее внимание уделяется значительным отклонениям от нормы (более 20%), меньшие отклонения могут быть вызваны случайными факторами – диетой, стрессами, физическими нагрузками, а также индивидуальными особенностями организма.

Показатели иммунологического анализа крови

Иммунологический анализ включает в себя комплекс показателей, отражающих состав и функциональную активность основных клеток иммунной защиты в разбивке по видам клеток и продукты их деятельности (иммуноглобулины). Развернутый анализ иммунной системы является достаточно сложным, требующим много времени, поэтому в зависимости от цели исследования иммунологический анализ может быть ограничен показателями, представляющими конкретную функцию иммунитета или затрагиваемые конкретной патологией.

Чаще всего исследуются:

  • субпопуляции лимфоцитов – белых кровяных телец, различные виды которых распознают чужеродные структуры (антигены), вырабатывают антитела, направленные против чужеродных агентов, регулируют интенсивность иммунных процессов, распознают и уничтожают изменённые клетки организма (например, раковые клетки);
  • иммуноглобулины – антитела, функцией которых является нейтрализация инфекционных возбудителей и токсинов. Прежде всего, исследуются иммуноглобулины классов A, M, G.

Иммуноглобулины A (IgA) обеспечивают местный иммунитет слизистых оболочек. Повышенный уровень IgA отмечается при заболеваниях кожи, органов пищеварения и дыхания. Также это характерно при интоксикациях, алкоголизме, патологии печени и почек.

Иммуноглобулины M (IgM) активно вырабатываются при первичной защитной реакции организма, поэтому их повышенное количество наблюдаются в начале любого заболевания. Повышенное значение IgM также наблюдается при заболеваниях печени (прежде всего гепатите или циррозе печени).

Иммуноглобулины G (IgG) — самый массовый класс иммуноглобулинов. Они являются основной защитой, вырабатываемой в ответ на проникновение в организм инфекции. Их задача – убивать грибок, вирус, патогенные бактерии, обезвреживать вырабатываемые возбудителем инфекции токсины. Именно они отвечают за длительный иммунитет, защищающий нас от повторного поражения инфекцией.

Иммуноглобулины Е и D, вырабатываются, в основном, в ответ на паразитарную инфекцию (поражение глистами) или в случае атопической аллергии.

Для определения чувствительности организма к тем или иным аллергенам проводится специальное исследование – аллергопанель, выявляющее специфические антитела к конкретной группе аллергенов (как правило это иммуноглобулины классов Е или G).

голоса
Рейтинг статьи
Ссылка на основную публикацию
ВсеИнструменты
Adblock
detector